擴增產(chǎn)物的檢測1．1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測：取10ulPCR擴增物作1.5%瓊脂糖凝膠電泳、0.5μg/ml溴化乙錠染色，以PGEM-3ZfDNA-HaeⅢ為分子量標(biāo)準(zhǔn)，置紫外透射儀觀察結(jié)果。

UU1：CAGATACATTAAACGAAGCAGGUU2：GTGGTGACATACCATTAACPCR擴增傳統(tǒng)的方法為的反應(yīng)體積為100μl，含5x反應(yīng)緩沖液20μl和FD-DNA聚合酶2μ、4種dNTP各200μmol/L以及引物對各25pmol/L。上述成分預(yù)先一次性分裝于0.5ml離心管，-20℃?zhèn)溆?。臨用加模板DNA2μl，短暫離心，加100μl礦物油覆蓋?，F(xiàn)在試劑已商品化，反應(yīng)體積為25μl，單管已分裝好，只要加入模板DNA即可。置DNA擴增儀進行40次循環(huán)擴增。每次循環(huán)包括90℃變性45s，55℃退火30s和72℃延伸40s三個步驟。每次擴增均應(yīng)作陰陽性對照。引物設(shè)計引物來源于解脲脲原體，脲酶基因序列：將宮頸管內(nèi)或尿道內(nèi)刮取物置含0.5%NP-40、0.5%Tween20，1%SDS和2mg/ml蛋白酶K的TES緩沖液，置37℃裂解60min，沸水5min，酚，氯仿抽提DNA乙醇沉淀，沉淀物溶于20μlTE緩沖液。2．解脲脲原體DNA提取：標(biāo)本處理1．取材部位為子宮頸管，男性為尿道，將滅菌白金耳深入宮頸管或尿道1cm左右，轉(zhuǎn)動數(shù)圈，停留約30s，取出后置標(biāo)本緩沖液中。3．基因診斷：利用DNA探針對支原體診斷其敏感性稍差，但特異性高，用聚合酶鏈反應(yīng)，敏感性、特異性均高。具體檢測方面如下：血清學(xué)診斷試驗：酶聯(lián)免疫吸附試驗敏感性高：微量免疫熒光法具有快速特點。2．血清學(xué)鑒定法：最常用的是瓊脂擴散法，即將支原體接種到瓊脂皿上。然后再用浸過適量血清的濾紙放到瓊脂表面，觀察哪一種能抑制支原體生長。也可用瓊脂表面的菌落作熒光抗體染色法，用落射熒光顯微鏡觀察，此法的優(yōu)點是可以利用最初生長在瓊脂表面上的菌落而不必將支原體傳代。b．常用培養(yǎng)基為牛心浸液或蛋白胨，并含1%新鮮酵母浸液，10-20%動物血清及0.5%氯化鈉，還可加葡萄糖和精氨酸以促進MH和MG生長，加入尿素以供UU代謝，適量加青霉素抑制雜菌。a．采集標(biāo)本，一般為泌尿生殖試子或刷片，少數(shù)取前列腺液，精液、關(guān)節(jié)液，或取輸卵管，直腸活檢物，近年來用初段尿標(biāo)本離心物，以取代尿道拭子。拭子取材時，將拭子插入男性尿道2-4cm，用力擦取。該方法容易造成尿道損傷及繼發(fā)感染。用時須慎重。女性則需先清潔宮頸鱗狀與柱狀上皮結(jié)合部，用細胞刷收集宮頸標(biāo)本，能增加感染細胞的數(shù)量，較棉拭子敏感性高。1．支原體培養(yǎng)：子宮內(nèi)膜炎診斷實驗診斷支原體感染的實驗室診斷主要是支原體的培養(yǎng)和血清學(xué)鑒定，目前主要采用基因診斷。六、子宮內(nèi)膜炎診斷及鑒別診斷子宮內(nèi)膜炎診斷臨床診斷有不潔性交史，有尿道、陰道分泌物及排尿灼痛表現(xiàn)者而又排除其他病原體感染的可能性，取尿道或?qū)m頸分泌物涂片，在1000倍顯微鏡下可見多形核白細胞≥5個，可作初步診斷。支原體感染常見的合并癥為輸卵管炎，少數(shù)患者可出現(xiàn)子宮內(nèi)膜炎及盆腔炎。女性患者多見以子宮頸為中心擴散的生殖系炎癥。多數(shù)無明顯自覺癥狀，少數(shù)重癥病人有陰道墜感，當(dāng)感染擴及尿道時，尿頻、尿急是引起病人注意的主要癥狀。感染局限在子宮頸，表現(xiàn)為白帶增多、混濁、子宮頸水腫、充血或表面糜爛。感染擴及尿道表現(xiàn)為尿道口潮紅、充血、擠壓尿道可有少量分泌物外溢，但很少有壓痛出現(xiàn)。亞急性期常合并前列腺感染，患者常出現(xiàn)會陰部脹痛、腰酸、雙股內(nèi)側(cè)不適感或在做提肛動作時有自會陰向股內(nèi)側(cè)發(fā)散的刺痛感。肛診時前列腺縱溝不明顯或表面類似核桃殼凹凸不平，少數(shù)病例B型超聲波診斷可證實不同程度的增大。合并副睪炎者不多見。